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产品使用说明书(Version 3.0)
产品名称:miRNA加尾法逆转录试剂盒
英文名称:microRNA Reverse Transcription Kit
货号规格:UR32061(50 Rxns×20 μL)
运输存储:冰袋运输,-20℃存储。
产品描述:
本试剂盒采用Poly(A)加尾反应和cDNA合成反应同步进行的方法来进行microRNA第一链cDNA的合成,包含了与此配套的通用型qPCR反向引物(Universal 3’qPCR Primer),仅需自行设计一条目的microRNA的特异性正向引物,就能够用于microRNA的定量检测。具体过程是:先通过Poly(A) Polymerase在microRNA的3’末端加Poly(A)尾,再使用Oligo(dT)-Universal Tag通用逆转录引物进行逆转录反应,最终生成microRNA的cDNA第一链。
本试剂盒为包含去除基因组DNA的高效DNase的快速逆转录试剂盒,主要含有4管试剂:gDNA Remover、miRNA RT Enzyme Mix、4× miRNA RT Buffer、Universal 3’qPCR Primer。其中,gDNA Remover中主要包括浓缩的DNase和buffer,仅需室温(19 ~ 27℃)反应5分钟,就能降解95%以上的基因组DNA,极大地降低了残留基因组对结果的干扰。
miRNA RT Enzyme Mix中主要包含了Poly(A) Polymerase、逆转录酶、RNase Inhibitor。其中的Poly(A) Polymerase不但具有高效的加Poly(A)尾效率,还特异性识别成熟的单链miRNA,从而避免了具有双链结构的miRNA前体的逆转录反应;逆转录酶采用新型M-MLV突变体逆转录酶,具有很强的抗干扰能力及扩增能力,扩增效率优异。
4×miRNA RT Buffer包含了miRNA加Poly(A)尾反应和逆转录反应的所有原料和引物,包括Oligo(dT)-universal tag通用逆转录引物、buffer和dNTPs,并经过精心优化,可保证miRNA 3’末端的Poly(A)修饰过程和逆转录过程同时高效进行。
产品组分:
产品使用:
使用前将各组分从冰箱中取出,冰上融化,上下颠倒5 ~ 10次使之充分混匀,然后使用
离心机短暂离心将管壁上附着的液体甩下来,置于冰上待用。
去除基因组DNA反应
1、 用gDNA Remover处理RNA:取100 ng ~ 1 μg总RNA或者10 ng ~ 20 ng miRNA(一般建议用0.5 μg的总RNA),加入1 μL的gDNA Remover(如果RNA浓度较高,加入后体积少于5 μL,则需要加ddH2O至5 μL),用移液器轻柔吹打5 ~ 10次混匀,室温(19 ~ 27℃)反应5分钟,置于冰上待用。
逆转录反应
2、 按照如下体系配制加尾和逆转录同时反应体系:
3、 按照上表加好试剂后,必须用移液器轻柔吹打10次充分混匀(注:移液器体积可调到18 μL进行吹打)。
4、 逆转录反应程序:37℃反应15分钟,42℃反应10分钟,95℃反应3分钟,即可得到包含所有miRNA的cDNA第一链。
逆转录反应得到的cDNA可直接作为模板进行qPCR反应,或者稀释5 ~ 10倍后再使用(具体的稀释倍数根据基因表达丰度来确定);如果模板cDNA不稀释,一般20 μL qPCR反应体系建议使用0.4 μL的cDNA
5、 (0.2 ~ 0.8 μL);如果模板cDNA稀释5倍,一般20 μL qPCR反应体系建议使用2 μL的cDNA(1 ~ 4 μL);如果模板cDNA稀释10倍,一般20 μL qPCR反应体系建议使用4 μL的cDNA(2 ~ 8 μL)。如不立即进行qPCR实验,建议将cDNA冻存于-80℃冰箱中。
microRNA的qPCR上游引物的设计:
1、 在microRNA数据库网站(例如miRBase,网址:http://www.mirbase.org/)上搜索得到目的microRNA成熟体序列。
2、 复制目的microRNA序列,将其中的U改成T,然后去掉3’端的最后6个碱基。
3、 在5’端加上3 ~ 6个碱基(目的是提高引物的Tm值,加入的序列以GC为主,例如CGGGC,GCGGGC,A/TGCCCG等),使上下游引物的Tm值相近,得到最终的正向引物序列。
常见的注意事项、操作要点及优化方法:
1、 实验开始前首先验证qPCR引物是否适用,标准与上述标准类似,主要观察扩增曲线与熔解曲线;
2、 引物验证后应该分装冻存,防止污染或降解;
3、 microRNA的质量及cDNA的质量对qPCR的结果具有很大的影响,应尽量保证microRNA不降解。RNA提取后应尽快进行逆转录反应,避免反复冻融,或者多次逆转录反应。如果预计使用量较大,则可以一次多逆转录几管cDNA。如果条件允许,cDNA建议保存在-80℃冰箱。
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